MitoLite 線(xiàn)粒體紅色熒光探針是一種陽(yáng)離子染料，可以通過(guò)線(xiàn)粒體膜電位梯度選擇性地積聚在線(xiàn)粒體中。線(xiàn)粒體指示劑是一種疏水性化合物，很容易透過(guò)完整的活細胞，并在進(jìn)入細胞后被線(xiàn)粒體捕獲。這種熒光線(xiàn)粒體指示劑長(cháng)時(shí)間保留在線(xiàn)粒體中，因為該指示劑帶有細胞保留基團。這一關(guān)鍵特性顯著(zhù)提高了染色效率。它可以很容易地適用于各種熒光平臺，如微孔板分析，免疫細胞化學(xué)和流式細胞術(shù)。它適用于增殖和非增殖細胞，可用于懸浮細胞和貼壁細胞。

操作步驟

1.準備線(xiàn)粒體染色溶液：

1.1解凍MitoLite 染料至室溫。

1.2通過(guò)將20μL500X Mitolite 染料稀釋到10 mL Hanks和20 mm Hepes緩沖液或緩沖液（HBSS）中，制備染料工作溶液。

注1：20μLMitolite 染料足以用于一個(gè)96孔板。 在<-15℃下分裝并儲存未使用的MitoLite 染料儲備溶液。 保護它免受光照，避免反復凍融循環(huán)。

注2：熒光線(xiàn)粒體指示劑的最佳濃度根據具體應用而變化。 可以根據特定細胞類(lèi)型和細胞或組織對探針的滲透性來(lái)修改染色條件。

2.準備和染色細胞：

2.1對于貼壁細胞：a.在96孔黑色壁/透明底板（100μL/孔/ 96孔板）中或在裝有適當培養基的培養皿內的蓋玻片上培養細胞。當細胞達到所需的匯合時(shí)，加入等體積的染料工作溶液（來(lái)自步驟1.2）。 b.將細胞在37oC，5％CO₂培養箱中孵育30分鐘至2小時(shí)。 c.用預熱（37oC）Hanks和20 mM Hepes緩沖液（HBSS）或您選擇的緩沖液（例如濃度為1：1的生長(cháng)培養基緩沖液）替換染料加載溶液或清洗（特別是對于＃22679）細胞。用HBSS或生長(cháng)培養基填充細胞孔。 d.使用配有所需濾光片組的熒光顯微鏡觀(guān)察細胞。

注意：如果細胞看起來(lái)沒(méi)有充分染色，建議增加標記濃度或孵育時(shí)間以使染料積累。

2.2對于懸浮細胞：將細胞以1000rpm離心5分鐘以獲得細胞沉淀并吸出上清液。在預熱（37℃）生長(cháng)培養基中輕輕重懸細胞沉淀，并加入等體積的染料加工溶液（來(lái)自步驟1.2）。將細胞在37℃，5％CO₂培養箱中孵育30分鐘至2小時(shí)。用Hanks和20mM Hepes緩沖液（HH緩沖液）或緩沖液替換染料加載溶液或洗滌（特別是對于＃22679）。（例如生長(cháng)培養基濃度為1：1的緩沖液）。用HBSS或生長(cháng)培養基填充細胞孔。使用配有所需濾光片組的熒光顯微鏡觀(guān)察細胞。

注1：如果細胞看起來(lái)沒(méi)有充分染色，建議增加標記濃度或培養時(shí)間以使染料積累。

注2：懸浮細胞可以附著(zhù)在用BD Cell-Tak?（BD Biosciences）處理過(guò)的蓋玻片上，并作為粘附細胞染色（見(jiàn)步驟2.1）。